泓迅生物精心編制的載體指南，不僅內(nèi)容詳盡，而且結(jié)構(gòu)清晰，旨在為科研工作者提供一個便捷的參考工具。在載體指南中，我們詳細介紹多種類型的載體，包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、克隆載體、表達載體等。我們針對每一種載體都進行詳盡的闡述，包括其特點、優(yōu)勢、限制、應(yīng)用等關(guān)鍵信息。
泓迅生物的載體指南是一份寶貴的學(xué)習(xí)資料，它將為您在科研道路上提供有力的支持和幫助。我們期待與您攜手共進，共同推動生物技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。
一、載體概述
載體
將目的基因（DNA片段）轉(zhuǎn)入目標細胞、組織或生物體中以實現(xiàn)基因克隆、表達、編輯等一系列功能研究，該方法是生物領(lǐng)域最常用的一種研究方法。在基因工程領(lǐng)域，為避免目的基因DNA片段序列的降解同時保證功能有效性，在轉(zhuǎn)入細胞、組織或生物體之前，需要先通過基因工程技術(shù)將目的基因構(gòu)建在一類具有在宿主細胞內(nèi)進行自主復(fù)制能力的DNA分子上，該類運輸工具被稱為載體（Vector）。其中，工程化的質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。
質(zhì)粒載體
質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子，常見于原核細菌及真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，具有分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少等特點。通過對天然質(zhì)粒進行元件添加、優(yōu)化等工程化改造，將其轉(zhuǎn)換成基因工程中最常用的載體，也稱為質(zhì)粒載體。
功能特點：
? 載裝能力：具有外源基因插入位點，外源基因插入該位點后不會破壞質(zhì)粒載體的功能。
? 運輸能力：將目標基因轉(zhuǎn)入細胞。
? 復(fù)制或整合能力：為目標基因提供復(fù)制能力或整合能力。
? 具有擴增或表達能力：為目標基因的擴增或表達提供必要條件。
? 具有篩選標記。
? 具有不相容性：含有相同Ori的2個不同的質(zhì)粒不能同時存在于1個細胞中。
基本組成元件：
（1）
復(fù)制起始點（Ori）：一段富含AT和重復(fù)序列的特定序列，通過招募復(fù)制相關(guān)蛋白啟動質(zhì)粒復(fù)制。Ori決定了質(zhì)粒在宿主中的拷貝數(shù)，高拷貝質(zhì)粒（10-60個拷貝）被稱為松弛型復(fù)制質(zhì)粒；低拷貝質(zhì)粒（1-3個拷貝）被稱為嚴緊型復(fù)制質(zhì)粒，通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個Ori，表示是原核的克隆或表達質(zhì)粒；有2個Ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，即可在原核也可在真核中復(fù)制。注意：具有相同的ori的質(zhì)粒具有不相容性，不可共轉(zhuǎn)染。
?。?）
抗性篩選基因（R）：即抗生素抗性基因，方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆。一般克隆發(fā)載體只有1種抗性篩選標記，部分穿梭質(zhì)粒具有2種抗性篩選標記。注意：原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致，原核生物中常見的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等；真核生物中常見的有Puro、G418、Hygr；原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
?。?）
多克隆位點（MCS）：即多個限制性內(nèi)切酶酶切位點匯集序列區(qū)，其中的每個酶切位點在整個質(zhì)粒載體中只有一個。MCS區(qū)是外源基因的插入位點，一般位于啟動子與轉(zhuǎn)錄終止信號元件之間。不同載體，MCS所包含的限制性內(nèi)切酶種類、數(shù)目不同。注意：插入基因序列過長會導(dǎo)致質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化效率變低。
?。?）
啟動子（P）：通過與RNApol特異型結(jié)合，啟動下游DNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動子決定基因表達的細胞類型及表達量。根據(jù)在細胞中啟動表達的形式不同，分為3類：組成型/廣譜型啟動子，組織/細胞基因特異性啟動子，誘導(dǎo)表達啟動子。
?。?）
增強子（Enhancer）：一種增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的順式作用元件，無方向性。
（6）
核糖體識別位點（RBS）：位于mRNA的起始密碼子（AUG）上游，核糖體可以識別、結(jié)合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達載體上的RBS為SD序列(位于AUG前面）；在真核生物中，主要依賴于mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu)，除此之外，IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動蛋白表達。
?。?）
轉(zhuǎn)錄終止子（Terminator）：位于待轉(zhuǎn)錄基因下游的3’端調(diào)控元件之后，主要為多聚腺苷酸化或聚（A）信號，具有終止轉(zhuǎn)錄功能。原核生物主要為polyA；真核生物如哺乳動物常見的終止子（SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob）包括促進聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。
?。?）引物結(jié)合位點（PBS）：一段短的單鏈DNA序列，可以與PCR擴增或測序的引物結(jié)合，主要用于質(zhì)粒序列的人工檢測。注意：該類位點可以根據(jù)應(yīng)用進行靈活設(shè)計。
二、質(zhì)粒載體分類
質(zhì)粒載體將目的基因?qū)胨拗骷毎?，進而實現(xiàn)基因功能表達，這些載體在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是推動合成生物學(xué)、生物醫(yī)藥、基因治療、靶點藥物篩選及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展的基礎(chǔ)。根據(jù)質(zhì)粒載體的多樣化應(yīng)用，其分類也是多樣化的，主要有以下幾種：
1、按照屬性質(zhì)粒載體可分為：病毒載體和非病毒載體。其中，病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體，通常通過將外源基因插入或替換病毒基因組的方式，將所需的基因輸送至目標細胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性，能夠在宿主細胞中高效地傳遞和表達外源基因。
病毒載體的應(yīng)用：
（1）基因治療：利用病毒載體將治療性基因?qū)氲侥繕思毎?，用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
?。?）基因編輯：利用病毒載體將基因編輯工具（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）輸送至目標細胞中，實現(xiàn)基因組的精準編輯和修飾。
?。?）疫苗開發(fā)：利用病毒載體作為疫苗遞送平臺，輸送目標抗原基因至免疫細胞中，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。
?。?）基因研究：在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達和藥物篩選等領(lǐng)域，病毒載體用于將特定基因傳遞到細胞或動物模型中，研究其功能和作用機制。
病毒載體分類及比較如下：
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載體類型
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定義
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特點
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優(yōu)勢
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限制
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慢病毒（LV）載體
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一種基于慢病毒（如人類免疫缺陷病毒HIV-1）的基因傳遞系統(tǒng)，去除了病毒的復(fù)制和致病基因，慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質(zhì)整合到宿主細胞的基因組中特性。
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1、整合能力：可將外源基因整合進宿主細胞的染色體DNA中。
2、宿主范圍廣：對分裂細胞和非分裂細胞都有感染能力。
3、可穩(wěn)定性表達。
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載荷容量較大：適用于攜帶較大基因片段或多個基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
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潛在致癌風(fēng)險：基因整合可能導(dǎo)致插入突變，增加致癌風(fēng)險。
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腺病毒載體
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一種基于腺病毒（Adenovirus）的基因轉(zhuǎn)移工具，腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，能夠在非分裂的細胞中高效地表達外源基因，不整合到宿主細胞基因組中，適合短期表達。
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1、非整合能力。
2、感染范圍廣：能夠感染包括分裂細胞和非分裂細胞在內(nèi)的廣泛宿主細胞。
3、瞬時表達。
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1、高效感染：能夠在短時間內(nèi)感染大量細胞。
2、安全性高：腺病毒載體不整合到宿主細胞染色體中，無插入致突變性。
3、高滴度：腺病毒載體可產(chǎn)生高滴度的病毒液，有利于大規(guī)模制備和應(yīng)用。
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1、瞬時表達：外源基因表達持續(xù)時間較短，需要多次接種以達到治療效果。
2、免疫反應(yīng)風(fēng)險：腺病毒具有較強的免疫原性，可能引發(fā)宿主細胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，影響治療效果。
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腺相關(guān)病毒（AAV）載體
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一種基于腺相關(guān)病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）的基因轉(zhuǎn)移工具，AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒，它與多種腺病毒有關(guān)，但與腺病毒不同，AAV本身不會引起疾病，因此在作為基因載體時具有很高的安全性。
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1、小型單鏈DNA病毒：基因組DNA＜5 kb，無包膜。
2、非致病性：AAV自然存在于人類中，但并不會導(dǎo)致任何已知的疾病。
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1、安全性高：AAV不會破壞宿主細胞的基因組，不會引起明顯的免疫反應(yīng)或病理反應(yīng)。
2、可長期表達：AAV可以在宿主細胞中長期表達外源基因。
3、靶向性：AAV有多種血清型，不同的AAV血清型可以靶向不同的細胞和組織。
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1、載體容量有限：AAV的基因組較小，能夠攜帶的外源基因序列長度有限，通常不超過4.5 kb。
2、免疫原性：雖然AAV的免疫原性較低，但在部分人群中仍可能引起免疫反應(yīng)。
3、制備成本高：AAV的制備過程較為復(fù)雜，成本較高。
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逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
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一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移工具，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常來源于能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的病毒，如人類免疫缺陷病毒（HIV）經(jīng)過改造后的形式。
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1、RNA病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒，其基因組以RNA形式存在。
2、逆轉(zhuǎn)錄機制：逆轉(zhuǎn)錄病毒利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并整合到宿主細胞基因組中。
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1、穩(wěn)定表達：由于整合到宿主基因組，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實現(xiàn)長期的基因表達。
2、較大基因載量：逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列，通?？蛇_8-10 kb。
3、感染效率高：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以感染多種類型的細胞，包括一些難以轉(zhuǎn)染的細胞類型。
4、技術(shù)成熟：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)相對成熟，有多種載體和包裝系統(tǒng)可供選擇。
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1、整合位點不確定性：逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機整合到宿主基因組中，可能引起插入突變，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和潛在的致癌風(fēng)險。
2、主要感染分裂細胞。
3、潛在的免疫反應(yīng)：盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒通常不會引起強烈的免疫反應(yīng)，但在某些情況下仍可能引發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
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2、按照進入受體細胞的類型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體（即可以存在于原核細胞，又可存在于真核細胞）。
3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒。
4、按照載體性質(zhì)不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠?qū)⑼庠椿蛘线M宿主細胞的基因組實現(xiàn)外源基因在宿主細胞中的穩(wěn)定表達，又稱為穩(wěn)定型表達載體；非融合型載體裝載著目標基因以游離的形式存在于細胞中，使得目標基因在宿主細胞中的短暫表達，又稱為瞬時表達載體。
瞬時表達載體與穩(wěn)定性表達載體比較如下：
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質(zhì)粒類型
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工作原理
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導(dǎo)入細胞方法
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特點
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優(yōu)勢
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限制
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應(yīng)用
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瞬時表達載體
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游離于細胞中，帶動目標基因在短時間內(nèi)快速表達并達到高峰，隨后逐漸降低。
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病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等。
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篩選標記基因是非必須元件；
表達快速、操作簡單。
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表達快速、操作簡單、靈活、成本低
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1、可能觸發(fā)細胞防御機制，導(dǎo)致基因沉默；
2、高效表達可能會對細胞產(chǎn)生毒性；
3、表達非永久且不穩(wěn)定。
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快速分析基因的功能或蛋白活性。
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穩(wěn)定表達載體
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將目標基因整合在宿主細胞基因組后使得目標基因持續(xù)且穩(wěn)定性表達。
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病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等
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篩選標記基因是必須元件；
持續(xù)穩(wěn)定表達
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長期穩(wěn)定表達、表達水平可控、遺傳穩(wěn)定性、安全性高、可重復(fù)性好
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1、轉(zhuǎn)化效率低；
2、細胞篩選周期長、成本高；
3、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化條件苛刻
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在基因工程、細胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如重組蛋白生產(chǎn)、基因功能研究、基因治療藥物開發(fā)等。
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5、按照功能不同可分為克隆載體、表達載體、基因編輯載體、表達調(diào)控載體、體外轉(zhuǎn)錄載體及功能檢測載體等。
? 克隆載體查看詳細
主要元件組成：復(fù)制起始點、多克隆位點及抗性篩選基因。
主要功能與應(yīng)用：用于DNA復(fù)制與擴增。
? 表達載體查看詳細
主要元件組成：除了克隆載體的基本元件，還須具備轉(zhuǎn)錄/翻譯所必須的DNA元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止信號。啟動子驅(qū)動目標基因轉(zhuǎn)錄生成RNA，合成的RNA在轉(zhuǎn)錄終止信號下停止轉(zhuǎn)錄。
（1）根據(jù)啟動子類型可分為組成型表達載體、組織特異性表達載體和誘導(dǎo)表達載體，比較如下：
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載體類型
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特點
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優(yōu)勢
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限制
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應(yīng)用
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組成型表達載體
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能在多種細胞類型或生物體中實現(xiàn)基因的持續(xù)表達。
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表達量高；
構(gòu)建及使用較為簡單；
通用性：不受細胞類型限制
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缺乏調(diào)控性：基因過表達可能對細胞產(chǎn)生毒性；
持續(xù)表達，消耗過量細胞資源，影響細胞的正常生理功能。
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通過基因亞細胞定位及過表達研究基因功能；
提高基因表達量以獲得大量目標蛋白
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組織特異性表達載體
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在特定的細胞類型、發(fā)育階段或環(huán)境條件下，對目標基因進行選擇性表達。
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特異性表達：能夠在特定的細胞類型、組織類型下實現(xiàn)外源基因的特異性表達，而不影響其他細胞或組織。
特定調(diào)控元件：如組織特異性啟動子、調(diào)節(jié)子或響應(yīng)元件等，用于調(diào)控外源基因的表達。
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復(fù)雜性：需要設(shè)計和構(gòu)建特異性調(diào)控元件，相對比較復(fù)雜，需要一定的技術(shù)和資源支持。
表達水平波動：外源基因的表達水平可能不夠穩(wěn)定，需要進一步優(yōu)化調(diào)控元件以提高表達的穩(wěn)定性。
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適用于多種研究或應(yīng)用領(lǐng)域，如基因治療、基因調(diào)控、生物傳感等。
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誘導(dǎo)表達載體
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含有特定的誘導(dǎo)或響應(yīng)元件，在特定的外部信號或誘導(dǎo)劑的作用下，對目標基因進行調(diào)控性表達。
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精確調(diào)控：可精確控制基因表達的時間和強度，有助于避免非特異性效應(yīng)。
節(jié)省成本：只在必要時誘導(dǎo)表達，避免了持續(xù)表達可能造成的資源浪費。
靈活性高：能夠根據(jù)需要選擇不同的誘導(dǎo)條件，實現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)表達或抑制。
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操作復(fù)雜：需要精確控制誘導(dǎo)劑的添加時間和濃度，以及可能需要考慮誘導(dǎo)劑對細胞的影響。
誘導(dǎo)條件限制：誘導(dǎo)型表達載體的誘導(dǎo)表達通常受到特定條件的限制，可能不適用于所有研究或應(yīng)用場景。
表達水平波動：不同實驗條件下，表達水平可能存在波動，需要精細調(diào)控。
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適用于特定條件下基因功能研究及蛋白的表達。
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（2）根據(jù)啟動子來源可分為哺乳動物表達載體、酵母表達載體、大腸桿菌表達載體等。
（3）根據(jù)目標基因類型可分為常規(guī)基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體、抗體蛋白表達載體等。
常規(guī)基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體及抗體蛋白表達載體比較如下：
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載體類型
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目標基因
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特點
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限制
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應(yīng)用
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常規(guī)基因表達載體
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未知功能的基因或特定序列
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具有篩選marker或報告基因元件：通過篩選marker或報告基因?qū)崿F(xiàn)基因的亞細胞定位或?qū)崿F(xiàn)基因過表達或恢復(fù)表達。
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免疫原性：部分表達載體會使宿主細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致載體被清除或細胞死亡。
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基因的功能研究
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重組蛋白表達載體
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編碼目標蛋白的基因序列
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根據(jù)目標蛋白設(shè)計出的基因序列，不一定是天然存在的；
含有目標蛋白篩選、純化的特定標簽元件；
具有多樣化的蛋白表達系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲細胞等。
啟動子多為誘導(dǎo)型表達啟動子；
具有良好的擴展性：從實驗級別到工業(yè)級別。
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1、成本高:從載體構(gòu)建到蛋白純化。
2、放大困難：主要受困于細胞生長條件、產(chǎn)物穩(wěn)定性維持等。
3、部分蛋白因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以正確折疊或易被宿主細胞降解等原因而無法高效表達。
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非編碼RNA表達載體
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miRNA、siRNA、lncRNA或circRNA等多種類型
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特異性：針對特定的基因或RNA分子進行RNA序列選擇及設(shè)計。
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1、引發(fā)免疫反應(yīng)；
2、出現(xiàn)非特異性調(diào)控；
3、穩(wěn)定性差：非編碼RNA 在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低
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1、調(diào)控基因表達；
2、可作為研究非編碼RNA生物學(xué)功能的有利工具；
3、具有治療某些由異常基因表達引起的疾病
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抗體蛋白表達載體
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編碼特定抗體的基因序列，包含編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA片段
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靈活性強:可表達多種類型的抗體，包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體等。
通過改造和優(yōu)化載體，還可以實現(xiàn)多基因共表達、融合蛋白表達等高級應(yīng)用。
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1、表達效率的不穩(wěn)定性：載體表達效率受到宿主細胞類型、培養(yǎng)條件、基因序列等因素導(dǎo)致表達效率的不穩(wěn)定。
2、活性不易控制：抗體聚集和錯誤折疊而失去活性。
3、純化成本高：昂貴的純化試劑和設(shè)備，增加了抗體生產(chǎn)的成本。
4、宿主細胞的安全性：某些宿主細胞（如哺乳動物細胞）進行抗體表達時，可能攜帶病毒、細菌或其他病原體，需要嚴格的生物安全措施來確保生產(chǎn)過程中的安全。
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抗體藥物研發(fā)
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主要功能與應(yīng)用：
（1）基因表達與功能研究：在特定宿主細胞中表達目標基因，并研究該基因在宿主細胞中的功能。這種技術(shù)對于理解基因在生物體內(nèi)的作用機制、基因功能發(fā)現(xiàn)等具有重要意義。
（2）蛋白生產(chǎn)：用于生產(chǎn)具有特定功能的蛋白質(zhì)。通過選擇適當?shù)乃拗骷毎捅磉_載體，可以高效地表達并純化目標蛋白，用于生物制藥、診斷試劑、工業(yè)酶等領(lǐng)域。
（3）基因療法：在基因治療領(lǐng)域，表達載體可將正常的基因?qū)氲交颊叩募毎?，以替換或修復(fù)缺陷基因。通過這種表達載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，可以實現(xiàn)基因在患者細胞中的長期、穩(wěn)定表達，從而達到治療疾病的目的。
（4）疫苗開發(fā)：表達載體將抗原基因?qū)胩囟ㄋ拗骷毎斜磉_，誘發(fā)免疫反應(yīng)可以制備出具有免疫原性的抗原蛋白。這些抗原蛋白可以用于制備疫苗，預(yù)防和控制傳染病的發(fā)生。
? 編輯載體查看詳細
編輯載體（Editing Vector）是一種用于基因編輯的分子工具，它通?；谫|(zhì)粒（plasmid）或其他DNA載體系統(tǒng)，并攜帶特定的基因編輯元件，如DNA核酸酶、識別序列以及模板DNA等，用于在目標生物體的基因組中進行精確的DNA序列修改。編輯載體的設(shè)計和構(gòu)建需要高度的專業(yè)知識和技能，以確保編輯的精確性和效率。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，編輯載體在生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景越來越廣闊。
主要功能與應(yīng)用：
（1）基因敲除：通過DNA核酸酶在特定位置切割DNA，然后依賴細胞的DNA修復(fù)機制（如非同源末端連接）來刪除或破壞基因。
（2）基因敲入：在DNA切割后，通過提供模板DNA來引導(dǎo)細胞進行同源重組，從而在特定位置插入新的DNA序列。
（3）基因修復(fù)：類似于基因敲入，但用于修復(fù)已存在的突變或缺陷。
根據(jù)編輯對象不同，主要分為CRISPR Cas9敲除載體和CRISPR Cas13敲除載體，比較如下表：
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載體類型
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定義
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特點
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編輯對象
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限制
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CRISPR Cas9敲除載體
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一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因敲除（Knockout，Ko）工具。載體上的Cas9蛋白來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，能夠精確地識別和切割目標DNA序列，實現(xiàn)基因的定點敲除。
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1、靈活性：載體構(gòu)建技術(shù)易于操作，可以通過改變Cas9蛋白的序列實現(xiàn)對不同DNA序列的剪切。
2、廣泛適用性：載體構(gòu)建技術(shù)可廣泛應(yīng)用于各種生物體系，包括細菌、酵母、植物、動物等。
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DNA
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1、脫靶效應(yīng)：存在一定的脫靶效應(yīng)。
2、基因組不穩(wěn)定性：引起的DNA斷裂和修復(fù)可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性，增加突變的風(fēng)險。
3、致癌風(fēng)險：研究表明，CRISPR Cas9-Ko載體可能引發(fā)某些類型的癌癥。
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CRISPR Cas13敲除載體
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Cas13是一種能夠切割RNA的CRISPR相關(guān)蛋白，具有高度的RNA識別和切割能力，能夠精確地識別和切割目標RNA序列。
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1、靈活性：Cas13-Ko載體可以靈活地針對不同的RNA序列進行編輯，只需要更換相應(yīng)的crRNA即可。
2、安全性：Cas13-Ko載體在RNA水平下進行編輯，不會改變基因組DNA序列，因此避免了可能由DNA編輯引起的脫靶效應(yīng)和基因突變等風(fēng)險。此外，Cas13-Ko載體在編輯過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少，對細胞毒性較低，進一步提高了其安全性。
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RNA
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1、脫靶效應(yīng)：盡管CRISPR Cas13在RNA識別方面具有較高的特異性，但仍存在一定的脫靶效應(yīng)風(fēng)險。
2、長期效果和安全性：CRISPR Cas13-Ko載體在RNA編輯方面的長期效果和安全性仍需要進一步研究和評估。
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? 表達調(diào)控載體查看詳細
表達調(diào)控載體通常包含啟動子、增強子、沉默子等必須的順式調(diào)控元件，以及一個或多個用于插入目標基因的多克隆位點。通過設(shè)計這些調(diào)控元件，研究人員可以精確地控制目標基因在特定時間、特定組織或特定條件下的表達水平。
主要功能與應(yīng)用：
（1）基礎(chǔ)科學(xué)研究：通過構(gòu)建表達調(diào)控載體，可以精確地控制目標基因在特定時間或特定細胞類型中的表達，從而深入研究該基因在生物體中的功能。
（2）代謝工程：通過精確控制關(guān)鍵酶的表達水平，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量或改變其代謝產(chǎn)物的比例。
（3）醫(yī)藥研發(fā)：通過調(diào)控治療基因的表達來糾正或補償缺陷基因的功能，實現(xiàn)疾病的基因治療。
（4）作物改良：通過提高抗旱、抗病或抗蟲基因的表達水平，增強作物的抗逆性。
根據(jù)調(diào)控表達形式主要分為CRISPRi載體及CRISPRa載體。詳情如下表：
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載體類型
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特點
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關(guān)鍵元件
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工作原理
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CRISPRi載體
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用CRISPR/Cas系統(tǒng)從阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始來抑制或沉默特定基因的表達；
CRISPRi介導(dǎo)的敲低是可誘導(dǎo)且可逆的。
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dCas9、sgRNA、KRAB
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主要依賴于dCas9（沒有切割活性的Cas9）和sgRNA（單鏈引導(dǎo)RNA）的復(fù)合物。當這個復(fù)合物被引導(dǎo)到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）時，dCas9能夠物理性地阻礙RNA聚合酶的通過，導(dǎo)致基因沉默。同時，dCas9可以融合一個基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB結(jié)構(gòu)域，進一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率。這種結(jié)構(gòu)域可以阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而抑制基因的表達。
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CRISPRa載體
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利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理進行基因激活表達；
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dCas9、sgRNA、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如VP64或p65AD）
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將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如VP64或p65AD）融合，形成一個具有轉(zhuǎn)錄激活功能的Cas9-激活域融合蛋白。當這個融合蛋白與sgRNA結(jié)合時，它可以被引導(dǎo)到目標基因的啟動子或增強子區(qū)段，并通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的作用，促進RNA聚合酶的招募和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而實現(xiàn)對目標基因的激活。
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? 體外轉(zhuǎn)錄載體查看詳細
體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription，IVT）載體，又稱為無細胞轉(zhuǎn)錄載體，是一種在實驗室條件下，利用純化的DNA作為模板，在試管或其他容器中進行的RNA合成過程。主要用于生產(chǎn)和研究RNA分子。
主要功能與應(yīng)用：
（1）mRNA疫苗和免疫治療：通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，可以制備出編碼特定抗原的mRNA，這些mRNA可以在體內(nèi)被細胞攝取并翻譯成蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種傳染病和腫瘤的疫苗研發(fā)中。
（2）基因功能研究：在分子生物學(xué)和生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究和教學(xué)領(lǐng)域，體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是一種重要的實驗工具。通過體外轉(zhuǎn)錄實驗，可以幫助學(xué)生和研究人員更深入地理解RNA的合成、加工和功能機制。
（3）生物合成和代謝工程：用于生產(chǎn)具有特定功能的RNA分子，如RNA酶、RNA適配體等。這些RNA可以用于生產(chǎn)特定的生物活性物質(zhì)或調(diào)節(jié)代謝途徑。
（4）診斷與檢測：還可以用于生產(chǎn)標記有放射性同位素或其他探針的RNA分子，通過檢測特定RNA分子的表達水平或結(jié)構(gòu)變化，可以判斷疾病的發(fā)病機制和病情進展。
根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同主要分為RNA體外轉(zhuǎn)錄載體和mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體。詳情如下表：
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載體類型
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必須元件
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IVT產(chǎn)物
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RNA體外轉(zhuǎn)錄載體
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T7啟動子
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RNA
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mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體
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T7啟動子、Kozark序列、5’UTR、3’UTR、polyA
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mRNA
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優(yōu)勢：
（1）高效快速：可以在短時間內(nèi)合成出大量的RNA/mRNA分子，滿足實驗需求。
（2）高純度：通過體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成的RNA/mRNA分子純度高，不需要經(jīng)過復(fù)雜的分離和純化步驟。
（3）靈活性：可以合成各種長度和序列的RNA/mRNA分子，適用于不同的實驗需求。
（4）可控性強：體外轉(zhuǎn)錄過程可以在實驗室內(nèi)進行控制，可以根據(jù)實驗需要調(diào)整反應(yīng)條件和時間。
（5）適用于大規(guī)模生產(chǎn)：由于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的高效性和可控性，它適用于大規(guī)模生產(chǎn)RNA分子，如mRNA疫苗的生產(chǎn)等。
限制：
（1）穩(wěn)定性受限：體外轉(zhuǎn)錄的RNA/mRNA分子在保存和運輸過程中可能受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。
（2）可能產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物：在體外轉(zhuǎn)錄過程中，可能會產(chǎn)生一些非特異性的RNA產(chǎn)物，影響實驗結(jié)果的準確性。
（3）不適用于所有類型的RNA合成：雖然體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以合成多種類型的RNA分子，但對于某些特殊的RNA結(jié)構(gòu)或功能可能無法實現(xiàn)有效合成。
? 啟動子功能檢測載體查看詳細
啟動子功能檢測載體將目標啟動子序列與報告基因（熒光蛋白、酶等）相連，并將其導(dǎo)入到目標細胞或組織中。當啟動子被激活時，會驅(qū)動報告基因的表達，通過觀察報告基因的表達情況來評估啟動子的活性。
關(guān)鍵元件：
一個啟動子插入位點及供啟動子驅(qū)動表達的報告基因，以及必要的調(diào)控序列和標記基因。
特點：
報告基因多樣：通常包含一個或多個報告基因，如熒光素酶或綠色熒光蛋白（GFP），用于衡量啟動子的活性。
應(yīng)用優(yōu)勢：
（1）快速篩選：能夠快速識別和評估啟動子的活性。
（2）定量分析：報告基因的表達水平可以量化，便于比較不同啟動子的效率。
（3）多樣性評估：適用于多種研究應(yīng)用，包括啟動子鑒定、功能分析和優(yōu)化。
（4）技術(shù)成熟：利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件活性及結(jié)合位點預(yù)測等實驗設(shè)計思路與細節(jié)已經(jīng)非常成熟。
應(yīng)用限制：
（1）背景噪聲：某些載體可能存在非特異性表達，導(dǎo)致背景噪聲。
（2）宿主限制：啟動子的活性可能受到宿主細胞類型的影響。
（3）成本：購買或構(gòu)建高特異性的檢測載體可能成本較高。
? 蛋白互作檢測載體查看詳細
蛋白互作檢測通常通過構(gòu)建融合蛋白表達載體來實現(xiàn)，其中目標蛋白序列與報告基因或標簽序列融合，并在宿主細胞中共表達這兩個融合蛋白。當這兩個融合蛋白發(fā)生相互作用時，它們能夠激活或抑制與它們相連的報告基因，從而引發(fā)可測量的信號變化，如熒光強度的增強或顏色的改變。通過檢測這些信號變化，研究人員能夠評估并量化蛋白質(zhì)之間的相互作用。
關(guān)鍵元件：
目標基因插入位點、用于報告蛋白互作的報告系統(tǒng)元件。
特點：
（1）雙報告基因系統(tǒng)：通常包含兩個報告基因，用于監(jiān)測蛋白間的相互作用。
（2）融合標簽：載體設(shè)計包含融合蛋白標簽，如GST、His或Flag，便于蛋白的純化和檢測。
（3）信號放大：一些載體通過信號放大機制提高檢測的靈敏度。
優(yōu)勢：
（1）實時監(jiān)測：可以實時監(jiān)測蛋白互作的動態(tài)過程。
（2）定量分析：提供了一種定量分析蛋白互作強度的方法。
（3）高通量篩選：適用于大規(guī)模篩選實驗，有助于快速識別互作蛋白。
（4）應(yīng)用廣泛：可用于藥物篩選、疾病機制研究和信號傳導(dǎo)途徑分析。
限制：
（1）假陽性/假陰性：可能由于非特異性結(jié)合或?qū)嶒灄l件不當導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
（2）局限性：蛋白互作檢測載體通常只能檢測到已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，對于未知的蛋白質(zhì)相互作用可能無法檢測。此外，一些低親和力或瞬時的蛋白質(zhì)相互作用也可能無法被檢測到。
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