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載體指南

泓迅生物精心編制的載體指南,不僅內(nèi)容詳盡,而且結(jié)構(gòu)清晰,旨在為科研工作者提供一個(gè)便捷的參考工具。在載體指南中,我們?cè)敿?xì)介紹多種類(lèi)型的載體,包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、克隆載體、表達(dá)載體等。我們針對(duì)每一種載體都進(jìn)行詳盡的闡述,包括其特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)、限制、應(yīng)用等關(guān)鍵信息。

泓迅生物的載體指南是一份寶貴的學(xué)習(xí)資料,它將為您在科研道路上提供有力的支持和幫助。我們期待與您攜手共進(jìn),共同推動(dòng)生物技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。


一、載體概述

載體

將目的基因(DNA片段)轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞、組織或生物體中以實(shí)現(xiàn)基因克隆、表達(dá)、編輯等一系列功能研究,該方法是生物領(lǐng)域最常用的一種研究方法。在基因工程領(lǐng)域,為避免目的基因DNA片段序列的降解同時(shí)保證功能有效性,在轉(zhuǎn)入細(xì)胞、組織或生物體之前,需要先通過(guò)基因工程技術(shù)將目的基因構(gòu)建在一類(lèi)具有在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制能力的DNA分子上,該類(lèi)運(yùn)輸工具被稱(chēng)為載體(Vector)。其中,工程化的質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。

質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子,常見(jiàn)于原核細(xì)菌及真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的,少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu),具有分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行元件添加、優(yōu)化等工程化改造,將其轉(zhuǎn)換成基因工程中最常用的載體,也稱(chēng)為質(zhì)粒載體。

功能特點(diǎn):

  ? 載裝能力:具有外源基因插入位點(diǎn),外源基因插入該位點(diǎn)后不會(huì)破壞質(zhì)粒載體的功能。
  ? 運(yùn)輸能力:將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
  ? 復(fù)制或整合能力:為目標(biāo)基因提供復(fù)制能力或整合能力。
  ? 具有擴(kuò)增或表達(dá)能力:為目標(biāo)基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要條件。
  ? 具有篩選標(biāo)記。
  ? 具有不相容性:含有相同Ori的2個(gè)不同的質(zhì)粒不能同時(shí)存在于1個(gè)細(xì)胞中。

基本組成元件:

  (1)復(fù)制起始點(diǎn)(Ori):一段富含AT和重復(fù)序列的特定序列,通過(guò)招募復(fù)制相關(guān)蛋白啟動(dòng)質(zhì)粒復(fù)制。Ori決定了質(zhì)粒在宿主中的拷貝數(shù),高拷貝質(zhì)粒(10-60個(gè)拷貝)被稱(chēng)為松弛型復(fù)制質(zhì)粒;低拷貝質(zhì)粒(1-3個(gè)拷貝)被稱(chēng)為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒,通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個(gè)Ori,表示是原核的克隆或表達(dá)質(zhì)粒;有2個(gè)Ori,則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒,即可在原核也可在真核中復(fù)制。注意:具有相同的ori的質(zhì)粒具有不相容性,不可共轉(zhuǎn)染。
 ?。?)抗性篩選基因(R):即抗生素抗性基因,方便后續(xù)通過(guò)抗生素篩選陽(yáng)性克隆。一般克隆發(fā)載體只有1種抗性篩選標(biāo)記,部分穿梭質(zhì)粒具有2種抗性篩選標(biāo)記。注意:原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致,原核生物中常見(jiàn)的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等;真核生物中常見(jiàn)的有Puro、G418、Hygr;原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
  (3)多克隆位點(diǎn)(MCS):即多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)匯集序列區(qū),其中的每個(gè)酶切位點(diǎn)在整個(gè)質(zhì)粒載體中只有一個(gè)。MCS區(qū)是外源基因的插入位點(diǎn),一般位于啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)元件之間。不同載體,MCS所包含的限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)、數(shù)目不同。注意:插入基因序列過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化效率變低。
 ?。?)啟動(dòng)子(P):通過(guò)與RNApol特異型結(jié)合,啟動(dòng)下游DNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列,本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子決定基因表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型及表達(dá)量。根據(jù)在細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)的形式不同,分為3類(lèi):組成型/廣譜型啟動(dòng)子,組織/細(xì)胞基因特異性啟動(dòng)子,誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。
 ?。?)增強(qiáng)子(Enhancer):一種增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的順式作用元件,無(wú)方向性。
 ?。?)核糖體識(shí)別位點(diǎn)(RBS):位于mRNA的起始密碼子(AUG)上游,核糖體可以識(shí)別、結(jié)合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達(dá)載體上的RBS為SD序列(位于AUG前面);在真核生物中,主要依賴(lài)于mRNA的5’端帽子結(jié)構(gòu),除此之外,IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動(dòng)蛋白表達(dá)。
  (7)轉(zhuǎn)錄終止子(Terminator):位于待轉(zhuǎn)錄基因下游的3’端調(diào)控元件之后,主要為多聚腺苷酸化或聚(A)信號(hào),具有終止轉(zhuǎn)錄功能。原核生物主要為polyA;真核生物如哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的終止子(SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob)包括促進(jìn)聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。

  (8)引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS):一段短的單鏈DNA序列,可以與PCR擴(kuò)增或測(cè)序的引物結(jié)合,主要用于質(zhì)粒序列的人工檢測(cè)。注意:該類(lèi)位點(diǎn)可以根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行靈活設(shè)計(jì)。


二、質(zhì)粒載體分類(lèi)

質(zhì)粒載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因功能表達(dá),這些載體在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,是推動(dòng)合成生物學(xué)、生物醫(yī)藥、基因治療、靶點(diǎn)藥物篩選及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展的基礎(chǔ)。根據(jù)質(zhì)粒載體的多樣化應(yīng)用,其分類(lèi)也是多樣化的,主要有以下幾種:

1、按照屬性質(zhì)粒載體可分為:病毒載體和非病毒載體。其中,病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體,通常通過(guò)將外源基因插入或替換病毒基因組的方式,將所需的基因輸送至目標(biāo)細(xì)胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性,能夠在宿主細(xì)胞中高效地傳遞和表達(dá)外源基因。

病毒載體的應(yīng)用:

  (1)基因治療:利用病毒載體將治療性基因?qū)氲侥繕?biāo)細(xì)胞中,用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
  (2)基因編輯:利用病毒載體將基因編輯工具(如CRISPR/Cas9系統(tǒng))輸送至目標(biāo)細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)基因組的精準(zhǔn)編輯和修飾。
  (3)疫苗開(kāi)發(fā):利用病毒載體作為疫苗遞送平臺(tái),輸送目標(biāo)抗原基因至免疫細(xì)胞中,誘導(dǎo)免疫反應(yīng),從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
  (4)基因研究:在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達(dá)和藥物篩選等領(lǐng)域,病毒載體用于將特定基因傳遞到細(xì)胞或動(dòng)物模型中,研究其功能和作用機(jī)制。

病毒載體分類(lèi)及比較如下:

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載體類(lèi)型 定義 特點(diǎn) 優(yōu)勢(shì) 限制
慢病毒(LV)載體 一種基于慢病毒(如人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1)的基因傳遞系統(tǒng),去除了病毒的復(fù)制和致病基因,慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中特性。 1、整合能力:可將外源基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體DNA中。
2、宿主范圍廣:對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞都有感染能力。
3、可穩(wěn)定性表達(dá)。
載荷容量較大:適用于攜帶較大基因片段或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 潛在致癌風(fēng)險(xiǎn):基因整合可能導(dǎo)致插入突變,增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。
腺病毒載體 一種基于腺病毒(Adenovirus)的基因轉(zhuǎn)移工具,腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒,能夠在非分裂的細(xì)胞中高效地表達(dá)外源基因,不整合到宿主細(xì)胞基因組中,適合短期表達(dá)。 1、非整合能力。
2、感染范圍廣:能夠感染包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞在內(nèi)的廣泛宿主細(xì)胞。
3、瞬時(shí)表達(dá)。
1、高效感染:能夠在短時(shí)間內(nèi)感染大量細(xì)胞。
2、安全性高:腺病毒載體不整合到宿主細(xì)胞染色體中,無(wú)插入致突變性。
3、高滴度:腺病毒載體可產(chǎn)生高滴度的病毒液,有利于大規(guī)模制備和應(yīng)用。
1、瞬時(shí)表達(dá):外源基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短,需要多次接種以達(dá)到治療效果。
2、免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn):腺病毒具有較強(qiáng)的免疫原性,可能引發(fā)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng),影響治療效果。
腺相關(guān)病毒(AAV)載體 一種基于腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)的基因轉(zhuǎn)移工具,AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒,它與多種腺病毒有關(guān),但與腺病毒不同,AAV本身不會(huì)引起疾病,因此在作為基因載體時(shí)具有很高的安全性。 1、小型單鏈DNA病毒:基因組DNA<5 kb,無(wú)包膜。
2、非致病性:AAV自然存在于人類(lèi)中,但并不會(huì)導(dǎo)致任何已知的疾病。
1、安全性高:AAV不會(huì)破壞宿主細(xì)胞的基因組,不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)或病理反應(yīng)。
2、可長(zhǎng)期表達(dá):AAV可以在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)外源基因。
3、靶向性:AAV有多種血清型,不同的AAV血清型可以靶向不同的細(xì)胞和組織。
1、載體容量有限:AAV的基因組較小,能夠攜帶的外源基因序列長(zhǎng)度有限,通常不超過(guò)4.5 kb。
2、免疫原性:雖然AAV的免疫原性較低,但在部分人群中仍可能引起免疫反應(yīng)。
3、制備成本高:AAV的制備過(guò)程較為復(fù)雜,成本較高。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移工具,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常來(lái)源于能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的病毒,如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)經(jīng)過(guò)改造后的形式。 1、RNA病毒:逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒,其基因組以RNA形式存在。
2、逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制:逆轉(zhuǎn)錄病毒利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA,并整合到宿主細(xì)胞基因組中。
1、穩(wěn)定表達(dá):由于整合到宿主基因組,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因表達(dá)。
2、較大基因載量:逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列,通??蛇_(dá)8-10 kb。
3、感染效率高:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以感染多種類(lèi)型的細(xì)胞,包括一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型。
4、技術(shù)成熟:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)相對(duì)成熟,有多種載體和包裝系統(tǒng)可供選擇。
1、整合位點(diǎn)不確定性:逆轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)整合到宿主基因組中,可能引起插入突變,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。
2、主要感染分裂細(xì)胞。
3、潛在的免疫反應(yīng):盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒通常不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),但在某些情況下仍可能引發(fā)宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。


2、按照進(jìn)入受體細(xì)胞的類(lèi)型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體(即可以存在于原核細(xì)胞,又可存在于真核細(xì)胞)。

3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒。

4、按照載體性質(zhì)不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠?qū)⑼庠椿蛘线M(jìn)宿主細(xì)胞的基因組實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá),又稱(chēng)為穩(wěn)定型表達(dá)載體;非融合型載體裝載著目標(biāo)基因以游離的形式存在于細(xì)胞中,使得目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中的短暫表達(dá),又稱(chēng)為瞬時(shí)表達(dá)載體。


瞬時(shí)表達(dá)載體與穩(wěn)定性表達(dá)載體比較如下:

質(zhì)粒類(lèi)型 工作原理 導(dǎo)入細(xì)胞方法 特點(diǎn) 優(yōu)勢(shì) 限制 應(yīng)用
瞬時(shí)表達(dá)載體 游離于細(xì)胞中,帶動(dòng)目標(biāo)基因在短時(shí)間內(nèi)快速表達(dá)并達(dá)到高峰,隨后逐漸降低。 病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等。 篩選標(biāo)記基因是非必須元件;
表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單。
表達(dá)快速、操作簡(jiǎn)單、靈活、成本低 1、可能觸發(fā)細(xì)胞防御機(jī)制,導(dǎo)致基因沉默;
2、高效表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性;
3、表達(dá)非永久且不穩(wěn)定。
快速分析基因的功能或蛋白活性。
穩(wěn)定表達(dá)載體 將目標(biāo)基因整合在宿主細(xì)胞基因組后使得目標(biāo)基因持續(xù)且穩(wěn)定性表達(dá)。 病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等 篩選標(biāo)記基因是必須元件;
持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)
長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)水平可控、遺傳穩(wěn)定性、安全性高、可重復(fù)性好 1、轉(zhuǎn)化效率低;
2、細(xì)胞篩選周期長(zhǎng)、成本高;
3、轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化條件苛刻
在基因工程、細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,如重組蛋白生產(chǎn)、基因功能研究、基因治療藥物開(kāi)發(fā)等。

5、按照功能不同可分為克隆載體、表達(dá)載體、基因編輯載體、表達(dá)調(diào)控載體、體外轉(zhuǎn)錄載體及功能檢測(cè)載體等。


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