在生物制藥研發(fā)過程中，穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株被稱為“藥物研發(fā)的基石”，尤其對單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）以及重組蛋白疫苗的開發(fā)具有核心支撐作用。一株高效且穩(wěn)定的細胞株，不僅直接影響目標蛋白的產(chǎn)量、產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)成本，還能夠顯著加快藥物上市進程，甚至將開發(fā)周期縮短數(shù)年，因而成為企業(yè)提升競爭力的戰(zhàn)略性資源。憑借其高度穩(wěn)定的遺傳特性和一致的蛋白表達能力，該類細胞株已被廣泛應用于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)、抗體藥物的工業(yè)化制備、結(jié)構(gòu)解析研究以及藥物篩選與功能評價等多個關(guān)鍵領(lǐng)域。

01. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的應用場景

• 抗體藥物生產(chǎn)：為臨床前和臨床階段提供穩(wěn)定、高表達的細胞株；
• 功能研究與篩選：用于抗體活性、親和力、特異性等體外評價；
• 一致性保證：穩(wěn)轉(zhuǎn)株提供批次間一致性，符合GMP生產(chǎn)要求；
• 基因功能研究：也可用于其他重組蛋白的穩(wěn)定表達研究。

單克隆抗體（mAb）是目前生物藥市場中占比最大的類別，廣泛應用于腫瘤、自身免疫病、感染性疾病等領(lǐng)域。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株作為mAb生產(chǎn)的起點，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)工藝開發(fā)、規(guī)?；D(zhuǎn)移和最終藥品的質(zhì)量屬性。近年來，隨著基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）和啟動子/載體系統(tǒng)的優(yōu)化，穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建效率顯著提升。

02. 技術(shù)流程與挑戰(zhàn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選流程

質(zhì)粒線性化與回收

使用限制性內(nèi)切酶（如PvuI）對表達質(zhì)粒進行線性化，并通過磁珠純化回收線性片段，確保后續(xù)整合效率。

細胞準備與電轉(zhuǎn)

常用宿主細胞CHO-K1，經(jīng)Optimem I洗滌后，與線性化質(zhì)粒混合，通過電轉(zhuǎn)儀（如Bio-Rad Gene Pulser Xcell）進行電轉(zhuǎn)，參數(shù)需優(yōu)化。

陽性篩選與擴增

使用含有篩選標記（如L-MSX）的培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染后的細胞進行壓力篩選，獲得陽性細胞池（cell pool）。

ELISA鑒定表達量

通過抗原包被、一抗/二抗孵育和TMB顯色，檢測細胞上清中抗體表達量，篩選高表達池。

單克隆篩選與擴增

采用有限稀釋法（limiting dilution）獲得單克隆，進一步擴大培養(yǎng)至搖瓶規(guī)模，進行Fed-batch培養(yǎng)驗證表達穩(wěn)定性。

表達量與活性驗證

通過SDS-PAGE、ELISA等方法驗證抗體表達量、完整性和生物活性。

》技術(shù)難點

高產(chǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建不僅要求高表達量，還需保證抗體分子的正確折疊、糖基化修飾和穩(wěn)定性。CHO-K1細胞是一個源自中國倉鼠卵巢的細胞系亞克隆，它因其卓越的重組蛋白生產(chǎn)能力、準確的人類-like翻譯后修飾能力和良好的安全性，成為了生產(chǎn)治療性蛋白（尤其是單克隆抗體）的首選平臺。具有以下優(yōu)勢：

• 卓越的生產(chǎn)能力：

經(jīng)過多年的工程化改造和篩選，CHO-K1細胞能夠?qū)崿F(xiàn)極高水平的重組蛋白表達。

• 準確的翻譯后修飾：

這是其最核心的優(yōu)勢。作為哺乳動物細胞，CHO-K1能夠完成復雜且與人類高度相似的翻譯后修飾，特別是糖基化(Glycosylation)。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（如抗體）具有正確的折疊結(jié)構(gòu)、功能和藥代動力學特性，保證了藥物的安全性和有效性。

• 良好的安全性：

CHO-K1細胞對人類病毒的易感性較低，且自身不產(chǎn)生已知的人類致病病毒，極大地降低了生物制藥產(chǎn)品中的病毒污染風險。

• 成熟的工藝平臺：

數(shù)十年的研究使得CHO-K1細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、篩選和放大工藝非常成熟。

03. 案例分享：抗體穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選實戰(zhàn)

在本案例中，我們通過PvuI線性化質(zhì)粒、電轉(zhuǎn)CHO細胞、L-MSX篩選和高通量ELISA鑒定，成功獲得一株表達量達0.8 g/L、活性優(yōu)良（EC50=0.004）的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆2B1。該細胞株經(jīng)Fed-batch培養(yǎng)驗證，表現(xiàn)出良好的生長穩(wěn)定性和表達一致性。

質(zhì)粒線性化：使用PvuI酶切，經(jīng)磁珠純化后獲得高純度線性化片段；

電轉(zhuǎn)與篩選：電轉(zhuǎn)后使用含L-MSX的CD CHO培養(yǎng)基篩選陽性池；

ELISA陽性克隆篩選：鑒定出80%以上為陽性克隆，其中2B1克隆表達量最高；

ELISA 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株抗體活性圖

Fed-batch培養(yǎng)：通過優(yōu)化補料策略，最終表達量達到0.8 g/L；

2B1 補料后表達不同天數(shù)的 SDS-PAGE 電泳圖

活性驗證：穩(wěn)轉(zhuǎn)株抗體活性（EC50=0.004）與瞬轉(zhuǎn)株（EC50=0.003）相當，表明穩(wěn)轉(zhuǎn)株具有良好的功能活性。

ELISA 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)和瞬轉(zhuǎn)表達 Flag 抗體的活性

結(jié)果表明，該穩(wěn)轉(zhuǎn)株不僅表達量高，且抗體結(jié)構(gòu)完整、活性良好，適用于后續(xù)放大生產(chǎn)。

泓迅生物穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選服務

泓迅生物提供一系列細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建和篩選服務，用于全長抗體及抗體片段、Fc融合蛋白、多種細胞表面受體、胞質(zhì)和分泌蛋白等重組蛋白/抗體的穩(wěn)定及規(guī)模化生產(chǎn)。

• CHO1.0穩(wěn)轉(zhuǎn)載體，配合嘌呤霉素+MTX篩選系統(tǒng)。
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• 高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及Pool篩選。
• 可對重組蛋白/抗體全長或片段進行個性化表達。

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