在生物制藥研發(fā)過(guò)程中，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株被稱為“藥物研發(fā)的基石”，尤其對(duì)單克隆抗體、雙特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）以及重組蛋白疫苗的開(kāi)發(fā)具有核心支撐作用。一株高效且穩(wěn)定的細(xì)胞株，不僅直接影響目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量、產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)成本，還能夠顯著加快藥物上市進(jìn)程，甚至將開(kāi)發(fā)周期縮短數(shù)年，因而成為企業(yè)提升競(jìng)爭(zhēng)力的戰(zhàn)略性資源。憑借其高度穩(wěn)定的遺傳特性和一致的蛋白表達(dá)能力，該類細(xì)胞株已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)、抗體藥物的工業(yè)化制備、結(jié)構(gòu)解析研究以及藥物篩選與功能評(píng)價(jià)等多個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域。

01. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的應(yīng)用場(chǎng)景

• 抗體藥物生產(chǎn)：為臨床前和臨床階段提供穩(wěn)定、高表達(dá)的細(xì)胞株；
• 功能研究與篩選：用于抗體活性、親和力、特異性等體外評(píng)價(jià)；
• 一致性保證：穩(wěn)轉(zhuǎn)株提供批次間一致性，符合GMP生產(chǎn)要求；
• 基因功能研究：也可用于其他重組蛋白的穩(wěn)定表達(dá)研究。

單克隆抗體（mAb）是目前生物藥市場(chǎng)中占比最大的類別，廣泛應(yīng)用于腫瘤、自身免疫病、感染性疾病等領(lǐng)域。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株作為mAb生產(chǎn)的起點(diǎn)，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)工藝開(kāi)發(fā)、規(guī)?；D(zhuǎn)移和最終藥品的質(zhì)量屬性。近年來(lái)，隨著基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）和啟動(dòng)子/載體系統(tǒng)的優(yōu)化，穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建效率顯著提升。

02. 技術(shù)流程與挑戰(zhàn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選流程

質(zhì)粒線性化與回收

使用限制性內(nèi)切酶（如PvuI）對(duì)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行線性化，并通過(guò)磁珠純化回收線性片段，確保后續(xù)整合效率。

細(xì)胞準(zhǔn)備與電轉(zhuǎn)

常用宿主細(xì)胞CHO-K1，經(jīng)Optimem I洗滌后，與線性化質(zhì)粒混合，通過(guò)電轉(zhuǎn)儀（如Bio-Rad Gene Pulser Xcell）進(jìn)行電轉(zhuǎn)，參數(shù)需優(yōu)化。

陽(yáng)性篩選與擴(kuò)增

使用含有篩選標(biāo)記（如L-MSX）的培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選，獲得陽(yáng)性細(xì)胞池（cell pool）。

ELISA鑒定表達(dá)量

通過(guò)抗原包被、一抗/二抗孵育和TMB顯色，檢測(cè)細(xì)胞上清中抗體表達(dá)量，篩選高表達(dá)池。

單克隆篩選與擴(kuò)增

采用有限稀釋法（limiting dilution）獲得單克隆，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)至搖瓶規(guī)模，進(jìn)行Fed-batch培養(yǎng)驗(yàn)證表達(dá)穩(wěn)定性。

表達(dá)量與活性驗(yàn)證

通過(guò)SDS-PAGE、ELISA等方法驗(yàn)證抗體表達(dá)量、完整性和生物活性。

》技術(shù)難點(diǎn)

高產(chǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建不僅要求高表達(dá)量，還需保證抗體分子的正確折疊、糖基化修飾和穩(wěn)定性。CHO-K1細(xì)胞是一個(gè)源自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞系亞克隆，它因其卓越的重組蛋白生產(chǎn)能力、準(zhǔn)確的人類-like翻譯后修飾能力和良好的安全性，成為了生產(chǎn)治療性蛋白（尤其是單克隆抗體）的首選平臺(tái)。具有以下優(yōu)勢(shì)：

• 卓越的生產(chǎn)能力：

經(jīng)過(guò)多年的工程化改造和篩選，CHO-K1細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)極高水平的重組蛋白表達(dá)。

• 準(zhǔn)確的翻譯后修飾：

這是其最核心的優(yōu)勢(shì)。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，CHO-K1能夠完成復(fù)雜且與人類高度相似的翻譯后修飾，特別是糖基化(Glycosylation)。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（如抗體）具有正確的折疊結(jié)構(gòu)、功能和藥代動(dòng)力學(xué)特性，保證了藥物的安全性和有效性。

• 良好的安全性：

CHO-K1細(xì)胞對(duì)人類病毒的易感性較低，且自身不產(chǎn)生已知的人類致病病毒，極大地降低了生物制藥產(chǎn)品中的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。

• 成熟的工藝平臺(tái)：

數(shù)十年的研究使得CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、篩選和放大工藝非常成熟。

03. 案例分享：抗體穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選實(shí)戰(zhàn)

在本案例中，我們通過(guò)PvuI線性化質(zhì)粒、電轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞、L-MSX篩選和高通量ELISA鑒定，成功獲得一株表達(dá)量達(dá)0.8 g/L、活性優(yōu)良（EC50=0.004）的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆2B1。該細(xì)胞株經(jīng)Fed-batch培養(yǎng)驗(yàn)證，表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)穩(wěn)定性和表達(dá)一致性。

質(zhì)粒線性化：使用PvuI酶切，經(jīng)磁珠純化后獲得高純度線性化片段；

電轉(zhuǎn)與篩選：電轉(zhuǎn)后使用含L-MSX的CD CHO培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性池；

ELISA陽(yáng)性克隆篩選：鑒定出80%以上為陽(yáng)性克隆，其中2B1克隆表達(dá)量最高；

ELISA 檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株抗體活性圖

Fed-batch培養(yǎng)：通過(guò)優(yōu)化補(bǔ)料策略，最終表達(dá)量達(dá)到0.8 g/L；

2B1 補(bǔ)料后表達(dá)不同天數(shù)的 SDS-PAGE 電泳圖

活性驗(yàn)證：穩(wěn)轉(zhuǎn)株抗體活性（EC50=0.004）與瞬轉(zhuǎn)株（EC50=0.003）相當(dāng)，表明穩(wěn)轉(zhuǎn)株具有良好的功能活性。

ELISA 檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)和瞬轉(zhuǎn)表達(dá) Flag 抗體的活性

結(jié)果表明，該穩(wěn)轉(zhuǎn)株不僅表達(dá)量高，且抗體結(jié)構(gòu)完整、活性良好，適用于后續(xù)放大生產(chǎn)。

泓迅生物穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選服務(wù)

泓迅生物提供一系列細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建和篩選服務(wù)，用于全長(zhǎng)抗體及抗體片段、Fc融合蛋白、多種細(xì)胞表面受體、胞質(zhì)和分泌蛋白等重組蛋白/抗體的穩(wěn)定及規(guī)?；a(chǎn)。

• CHO1.0穩(wěn)轉(zhuǎn)載體，配合嘌呤霉素+MTX篩選系統(tǒng)。
• 從基因合成到篩選，提供全流程服務(wù)。
• 高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及Pool篩選。
• 可對(duì)重組蛋白/抗體全長(zhǎng)或片段進(jìn)行個(gè)性化表達(dá)。

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泓迅科技作為合成生物學(xué)賦能技術(shù)的領(lǐng)導(dǎo)者之一,建立了全面的抗體工程一站式服務(wù)平臺(tái),提供基于抗體“讀”(測(cè)序&設(shè)計(jì))-“寫”(合成&表達(dá))一“編”(親和力成熟&人源化&耦連)的全方位技術(shù)服務(wù),為科研院所和生物制藥公司提供高效、高品質(zhì)、高性價(jià)比的工程抗體及技術(shù)支持。

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